信帆生物代做免疫組化實驗，技術穩定，實驗結果可靠。提供技術指導和售后服務，價格實惠！歡迎廣大科研客戶朋友！代測，試劑盒!

免疫組化實驗檢測主要操作步驟：

1、洗載玻片：將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中，目的是為了是載玻片上的硅膠等除去，同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整，便于組織吸附，然后置于清水中清洗，除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右)，再將載玻片浸泡于酒精之中，然后放到架子上，置于37°C溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數的組織帶負電荷，從而產生吸附作用。
2、包埋組織：先在鐵模具中加入一些液態石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，進行冷凍，使石蠟變成固態。
3、切片：將包埋好的組織從模具上取下來，并置于石蠟切片機上，切片機通過調節上下左右來來使組織和切割方向，然后調節切片的厚度，一般為5µm，如果比較難切，則可以適當調整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
4、撈組織：當組織載玻片置于40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候方向，以便觀察，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。
5、脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯，依據的是相似相溶的原理。一般在每個試劑中放10min，天氣熱可以少放幾分鐘，相反，天氣較冷的話，就要適當延長脫蠟時間，一般為12-15min。
6、抗原修復：脫蠟后在清水中沖洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內源性的*酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。
7、血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來，然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。
8、加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過一夜。
9、加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后置于37°C溫箱中半小時。
10、加SABC：將片子從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC，然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
11、加顯色劑：將片子從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB、B：H2O2、    C：磷酸緩沖液。
12、復染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動物組織為半分鐘，植物組織3-5min。
13、脫水：將復染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通風柜中。
14、封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側，然后輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好片子后置于通風柜中晾干。

免疫組化實驗檢測注意事項：

切片組織得到很好處理后在進行切片之前還應對玻璃片進行處理，由于我們檢測抗原是多種多樣的，因染色操作程序復雜，時間較長，有些抗原是要進行各種抗原修復處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證實驗的正常進行，要求在貼片前對載玻片作適當處理，必須在清洗干凈的玻片上進行粘合劑的處理以防脫片。

1)Poly-L-Lysine 

一般采用分子量30000左右的0.5%多聚賴氨酸，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優點是可以用于多種組織化學、及分子學檢測中的應用，粘貼效果，但價格稍貴。

2)明膠硫酸鉻鉀法

將2.5g明膠加熱溶于500ml蒸餾水中，溶解冷卻后加入0.25g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2 min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價格便宜、方法簡單，任何實驗都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應注意，如果液體變藍或粘稠狀停用。

3)APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)

此法必須現用現配。將洗凈玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現氣泡。

切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕，如有上述問題的切片在進行染色都將出現假陽性現象，切片厚度一般為3~4μm，切好的切片在60℃溫箱中過一夜，注意烤片的溫度不宜過高，否則易使組織細胞結構破壞，而產生抗原標記定位彌漫現象。

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