Western Blot中關于抗體的相關問題！

1、做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

解答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般用HRP標記的二抗。

2、同一公司的不同抗體用某個稀釋度對一種抗體效果好，另外一種抗體可不可以用同種稀釋度進行稀釋？
解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其*的抗體稀釋度也是不一樣的，需要進行實驗摸索。
 

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3、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
解答：免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。（限于單抗）

4、Western Blot 中抗體的重復應用問題
解答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4℃保存，避免反復凍融。

5、做western每次只加一種一抗，可以同時加兩種或者多種一抗的嗎？
解答：還是不要同時加兩種一抗。因為如果結果里面有非特異信號的話，就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。 

6、酶顯色與熒光顯色之間，各自的優缺點是什么？
解答：免疫酶技術就是用酶（如辣根過氧化物酶）標記已知抗體（或抗原），然后與組織標本在一定條件下反應，如果組織中含有相應抗原（或抗體），抗原抗體相互結合形成的復合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或還原，產生顯色反應，這樣就可以識別出標本抗原（抗體）分布的位置和性質，通過圖像分析并可達到定量的目的。

免疫熒光技術雖已廣泛應用于免疫學的研究與診斷，但是熒光抗體染色標本不能保存，對組織細胞的細微結構分辨不清，免疫酶技術則能克服上述不足，標記免疫酶技術的敏感性更優于免疫熒光法，對石蠟切片標本尤為適用，為免疫病理研究開辟了一條新途徑，酶顯色產物具有較高的電子密度，經過適當處理還可以進行免疫電鏡觀察，免疫酶組化技術分為酶標記法與非標記抗體技術，前者是將酶通過交聯劑結合在抗體分子上，形成酶標記抗體。后者是將酶作為抗原與相應的特異性抗體連接進行的免疫反應，稱為非標記抗體酶技術。

Western Blot中關于抗體的相關問題！