明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理！

發(fā)布時(shí)間： 2023-04-24　　點(diǎn)擊次數(shù)： 926次

明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理！

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無(wú)活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細(xì)胞外基質(zhì)，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程，其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視。
檢測(cè)原理：

本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)1 nM，高于ELISA方法，其基本原理1和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時(shí)指MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液，可檢測(cè)少至0.1~0.5 μl 血中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測(cè)靈敏度~1nM。試劑盒可進(jìn)行50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè)，如果小膠加樣孔為10~15個(gè)，則總計(jì)可檢測(cè)500~750個(gè)樣品。

產(chǎn)品組成：

A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC；

B. 10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC；

C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；

D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；

E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液, 4 oC。

實(shí)驗(yàn)步驟（僅供參考）：
1.制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 oC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

2 .待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽(yáng)性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。

注：因?yàn)槿煞謴?fù)雜,MMP活性較低，方法是將全血中白蛋白進(jìn)行分離做陽(yáng)性對(duì)照
3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。
4 .洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水釋)，室溫漂洗凝膠2 × 18 小時(shí)，中間換液。如MMP 活性低，Buffer A 孵育時(shí)間可延長(zhǎng) 至36-48小時(shí)，中間24小時(shí)換液一次。

5. 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37oC 孵育1~5 小時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照或者血中的MMP 通常37oC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過夜。

6 .顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽(yáng)性對(duì)照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

7 .條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可

用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶

則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中最常見的格式。

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