食品安全快速檢測技術(shù)

1、免疫定義：



機(jī)體識別自身非自身，并清除非自身大分子物質(zhì)，從而保持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境平衡的一種生理反應(yīng)


2、 快速檢測含義：



包括樣品制備在內(nèi)，能夠在短時間內(nèi)出具檢測結(jié)果的行為稱之為快速檢測。三方面體現(xiàn)（1）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備要簡化（2）樣品經(jīng)簡單前處理后即可測試，后采用快速的樣品處理方式（3）分析方法簡單，快速，準(zhǔn)確



3、食品安全快速檢測分類：



1）按分析地點(diǎn)：現(xiàn)場快速檢測，實(shí)驗(yàn)室快速檢測

2）按定性定量：定性快速篩選檢驗(yàn)，半定量檢驗(yàn)，全量檢驗(yàn)



4、農(nóng)藥殘留檢測方法：



(一)生物法：

（1）生物化學(xué)測定法(酶抑制率法，速測卡法)

（2）分子生物學(xué)方法(如：ELISA)

（3）活體生物測定法(發(fā)光細(xì)菌，大型水藻，家蠅)

（4）生物傳感器法

(二)化學(xué)方法 酶抑制法 酶聯(lián)免疫檢測法



5、食品安全問題主要有害污染物:



（1）農(nóng)藥,化肥:有機(jī)磷,有機(jī)氯，硝酸鹽

（2）獸藥：興=奮劑，鎮(zhèn)靜劑，抗生素

（3）重金屬離子：鎘，鉛，汞，鉻，砷，鉬

（4）生物毒素：黃曲=霉毒素，嘔吐毒素，肉毒素

（5）致病菌：大腸桿菌，沙門氏菌，葡萄球菌等




6、 免疫基本特征：



識別自身和非自身，特異性，免疫記憶



7、免疫的基本功能：



抵抗感染，自身穩(wěn)定，免疫監(jiān)視



8、 抗原定義：



能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫答應(yīng)，并且能與答應(yīng)物(抗體或效應(yīng)性淋巴細(xì)胞)特異性結(jié)合的物質(zhì)，稱為抗原(Antigen，Ag)



9、 抗原具有抗原性：



免疫原性，反應(yīng)原性



10、抗原分類(按抗原性質(zhì))：



*抗原，半抗原(某些藥物)



11、抗原表位，又稱抗原決定簇：



是位于抗原物質(zhì)分子表面或者其他部位的具有一定組成和結(jié)構(gòu)的特殊化學(xué)基團(tuán)



12、抗體：



有抗原刺激動物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)B細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生，分泌的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。并非所有的免疫球蛋白都是抗體



13、抗體基本結(jié)構(gòu)：



a.重鏈H 2條 輕鏈L 2條

b.恒定區(qū)C區(qū) 可變區(qū)V區(qū)

c.鉸鏈區(qū)d.Fab抗原結(jié)合片段 Fc：可結(jié)晶片段



14、ELISA的原理：



（1）抗原或抗體能以物理性吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性

（2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物,而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性

（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后,可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在,而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)準(zhǔn)中相應(yīng)抗原或抗體的量成一定比例的,因此,可以按底物顯色的程度顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果



15、ESISA的類型:



（1）雙抗夾心法(測微生物)

（2）間接法測抗體

（3）競爭法測抗原(化肥農(nóng)藥)



16、雙抗體夾心法基本原理:



利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物，由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比(在方法可檢測范圈內(nèi)),測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值) ，即可確定待測抗原含量



17、間接法測抗體基本原理:



將抗原連接到固相載體上，樣品中待測抗體與之結(jié)合成固相抗原-受檢抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗(針對案檢抗體的抗體，如羊抗人ICG抗體)與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-受檢抗體-酶栝二抗復(fù)合物，測定加底物后的顯色程度，測定待測抗體含量



18、競爭法測抗原基本原理：



首先將特異性抗體吸附于固相載體表面(包被)，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測抗原的混合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合(標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶抗原愈少，后的顯色也愈淺)，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，兩組底物降解量之差，即為我們所要測定的未知抗原的量



19、農(nóng)藥殘留生物化學(xué)測定方法：



（1）農(nóng)藥速測卡法

（2）農(nóng)藥殘留分光光度法(抑制率法)



20、速測卡法檢測原理：



膽堿醋酶可催化靛酚乙酸酮(紅色)水解為乙酸與靛酚(藍(lán)色)有機(jī)磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥對膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解，變色的過程發(fā)生改變，由此判斷樣品中是否含有過量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留



分析步驟：

A.提取：干凈的菜樣品---剪碎(1CM左右見方)---取5g于帶蓋瓶中---加純凈水或緩沖溶液(l0mL)---震搖(50次)---靜置(2min以上)

B.預(yù)反應(yīng)：取一片速測卡，用白色藥片沾取提取液，放置10min以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時在37℃恒溫裝放置中10min.預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤

C.反應(yīng)：將速測卡對折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng) d.每批測定應(yīng)設(shè)一個純凈水或緩沖液的空白對照卡



21、速測卡法結(jié)果判定：



與空白對照卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍(lán)色均為陽性結(jié)果，不變藍(lán)為陽性結(jié)果，說明農(nóng)藥殘留量較高，顯淺藍(lán)色為弱陽性結(jié)果，說明農(nóng)藥殘留量相對較低。白色藥片變?yōu)樘焖{(lán)色或空白對照卡片相同，為陰性結(jié)果。對陽性結(jié)果的樣品，可用其他分析方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量



22、農(nóng)藥殘留分光光度計(jì)法(抑制率法)原理：



一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度成正相關(guān).，正常情況下，酶催化乙酰膽堿水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計(jì)在412nm處測定發(fā)光度隨時間的變化值，計(jì)算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有有機(jī)磷確和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在



23、酶傳感器：



它將活性物質(zhì)酶覆蓋在電極表面，酶與被測的有機(jī)物或無機(jī)物反應(yīng)，形成一種能被電極響應(yīng)的物質(zhì)



24、生物傳感器在食品分析中的應(yīng)用：



（1）食品成分分析

（2）食品添加劑的分析

（3）農(nóng)藥和抗生素殘留量分析

（4）微生物和生物毒素的檢驗(yàn)

（5）食品限度的檢驗(yàn)



25、蔬菜中硝酸鹽含量的快速測定原理：



將NO3-還原N02-后，芳香胺與亞硝酸根離子發(fā)生重氮化反應(yīng)，生成重氮鹽，重氮鹽再與芳香族化合物發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，生成一種紅顏色偶氮化合物(偶氮染料)，其顏色強(qiáng)度與硝酸鹽含量呈正比，通過試紙由無色變?yōu)榧t色，變色的試紙放入基于光學(xué)傳感器原理的硝酸鹽檢測儀中比色測定硝酸鹽含量。儀器與材料：硝酸鹽試紙. 快速測定儀



26、硝酸鹽速測管



（1）適用范圍：乳品、飲用水、蔬菜等食物中硝酸鹽的快速檢測

（2）方法原理：按照國標(biāo)GB/T5009. 33鹽酸蔡乙二胺顯色原理，在格林試劑中加入硝酸鹽轉(zhuǎn)化劑，并將其做成速測管，速測管中的試劑可將N03-還原為N02-后，再與芳香胺(氨基苯磺酸) 發(fā)生重氮反應(yīng)，生成重氮鹽，重氮鹽再與芳香族化合物( A-祭胺)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，生成紅色偶氮化合物(又叫偶氮染料)，顏色深淺與硝酸鹽含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)色卡比對，確定硝酸鹽含量



27、獸藥殘留定義：



動物產(chǎn)品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)殘留



28、獸藥殘留快速檢測微生物法檢測原理：



檢測管中的培養(yǎng)基預(yù)先接種了嗜熱脂肪芽孢桿菌，并含有細(xì)菌生長所需的營養(yǎng)以及pH指示劑。只需加入100ul樣品于檢測管中



將含有樣品的檢測管放入64±1℃水浴中加熱一段時間。奶或奶制品在培養(yǎng)基中迅速擴(kuò)散，若該樣品中不含有抗生素(或者抗生素低于檢測值)，嗜熱脂肪芽孢桿菌將在培養(yǎng)基中生長，葡萄糖唄分解后所產(chǎn)生的酸會改變Ph指示劑顏色，由紫色變?yōu)辄S色。相反若高于檢測限的抑菌劑，則嗜熱脂肪芽孢桿菌不會生長，指示劑顏色不變 仍為紫色



黃色表明該樣品沒有抗生素殘留或抗生素殘留的含量低于試劑盒的檢測限(陰性) 紫色表明該樣品中含有抗生素殘留 且濃度高于試劑盒的檢測限(陽性) 如果介于黃色紫色之間，則說明該樣品可能不含抗生素殘留或者抗生素殘留的含量低于試劑盒的檢測限(部分陽性)



29、放射免疫測定法原理：



放射免疫RIA：以標(biāo)記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競爭結(jié)合特異性抗體來測定的待檢樣品中抗原量。免疫放射IRMA：以過量標(biāo)記抗體與抗原非競爭結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離游離和結(jié)合標(biāo)記抗體。其他：放射受體分析RRA;放射配體結(jié)合分析RBA


30、免疫金標(biāo)記技術(shù)原理：



膠體金顆粒表面負(fù)電荷與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。膠體金對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面，無共價鍵形成，標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。金顆粒具有高電子密度的特性。金標(biāo)蛋白在相應(yīng)的配體處大量聚集時，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒或肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)



31、膠體金概念：



氯金酸在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)